Bst8.0 DNA聚合酶

产品货号：

YTB4101

中文名称：

Bst8.0 DNA聚合酶

英文名称：

Bst8.0 DNA/RNA Polymerase

产品规格：

8kU|40kU

发货周期：

1～3天

产品价格：

询价

本制品是Bst DNA聚合酶，大片段(货号：YTB4033)的一种同源蛋白，即嗜热脂肪芽孢杆菌DNA聚合酶大片段的同源蛋白，和Bst DNA聚合酶大片段相比，具有更强的5'→3' DNA聚合酶活性、更强的链置换能力、dUTP耐受性、耐盐性以及非离子去垢剂耐受性。Bst8.0 DNA聚合酶不具有5'→3'和3'→5'的核酸外切酶活性，可应用于环介导的等温扩增(LAMP)、交叉引物扩增技术(CPA)、滚环扩增(RCA)和基于滚环扩增的等温扩增反应等。Bst8.0 DNA聚合酶介导的等温扩增温度一般在50～72℃之间，通常为65℃，最佳温度与所使用的引物和扩增的产物有关，需要通过实验进行优化。

本制品与同类公司的Bst 3.0 DNA Polymerase相比，不仅具有相当的DNA聚合酶活性(图1)、链置换能力、dUTP耐受性和耐高温特性(可耐受72℃)(图2)；并具有更好的逆转录酶活性和更强的dUTP耐受性(图3和图4)，可应用于逆转录环介导的等温扩增(RT-LAMP)。

本制品具有Bst6.0 DNA聚合酶(货号：YTB4100)的所有优秀特性；与Bst6.0 DNA聚合酶相比，本制品不仅具有相当的DNA聚合酶活性(图1)、链置换能力、耐盐性和非离子去垢剂耐受性，还具有更好的耐高温特性(可耐受72℃)(图2)、更好的逆转录酶活性和更强的dUTP耐受性(图3和图4)。

环介导等温扩增(LAMP)、逆转录环介导等温扩增(RT-LAMP) (反应温度可达72℃)、交叉引物扩增技术(CPA)、滚环扩增(RCA)和解旋酶等温扩增(HDA)等DNA等温扩增，多重置换扩增(MDA)，链置换DNA合成，全基因组扩增(WGA)，高GC含量的DNA的测序，纳克级DNA模板的快速测序，建库测序等。

活性定义

一个活性单位是指65℃，30分钟内将10nmol dNTP掺入酸不溶性物所需的酶量。

产品来源

Bst 8.0 DNA聚合酶通过大肠杆菌重组表达和纯化而获得。

产品组成

组分	8kU	40kU
Bst8.0 DNA聚合酶(40U/μL)	200μL	1mL
10×Bst8.0 Reaction Buffer	600μL	3mL
100mM MgSO4	400μL	2mL

保存：-20℃，有效期2年。

酶储存液

10mM Tris-HCl，50mM KCl，0.1mM EDTA，1mM DTT，0.1% Triton X-100，50% Glycerol，pH7.5@25℃。

缓冲体系

10×Bst8.0 Reaction Buffer：
200mM Tris-HCl，500mM KCl，100mM (NH₄)₂SO₄，20mM MgS₀₄，1% Tween-20，pH8.8@25℃。

质量控制

无DNA内切酶和外切酶活性。

失活抑制

80℃加热5分钟可使Bst 8.0 DNA聚合酶失活。

注意事项

Bst8.0 DNA聚合酶不具有5'→3'的核酸外切酶活性。
建议等温扩增反应温度不能高于72℃，否则会导致酶较快速度失活。
Bst8.0 DNA聚合酶不能用于热循环测序或PCR。
每次等温扩增实验建议设置仅无模板DNA的阴性对照，以排除背景性扩增。
Bst8.0 DNA聚合酶使用时宜存放在冰盒内或冰浴上，使用完毕后宜立即放置于-20℃保存。

引物设计。
环介导的等温扩增引物的设计可以参考http://primerexplorer.jp/e/，建议使用V5版本，具体操作手册可以在http://primerexplorer.jp/e/v5_manual/index.html下载。环介导等温扩增引物的初步筛选可参照该操作手册，具体需要通过实验来验证比较合适的引物。LAMP引物由4个或6个(含Loop)引物组成，建议加入Loop环引物设计，即设计6条引物进行实验。

以LAMP等温扩增为例，参考下表设置反应体系。

成分	用量	终浓度
无菌无酶超纯水(货号：YT998)	(15.6-x)μL	-
10×Bst8.0 Reaction Buffer	2.5μL	1×
100mM MgSO₄	1.5μL	6mM(8mM total)
dNTP混合液(各25mM，货号：YTB4052)	1.4μL	各1.4mM
FIP/BIP Primers(25×,40μM)	1μL	1.6μM
F3/B3 Primers(25×,5μM)	1μL	0.2μM
Loop F/B Primers(25×,10μM)	1μL	0.4μM
DNA或RNA模板	xμL	＞10copies
Bst8.0 DNA聚合酶(40U/μL)	1μL	1600U/mL
总体积	25μL	-

在配制反应体系完成后，可每25μL体系的反应管管盖加适量高浓度的SYBR Green I 1μL，待等温扩增反应结束后，8000×g离心1分钟，反应体系变荧光绿为阳性，保持无色或棕色为阴性。也可以无需添加指示剂，待反应程序结束后，可见反应液明显变浑浊为阳性，反应液保持透明为阴性。
如需优化反应，可调整Mg²⁺浓度(4～10mM)，酶量(0.04～0.32U/μL)或改变反应温度(50～72℃)。
如果通过琼脂糖凝胶电泳或其它需要打开LAMP反应容器的方法进行分析，请设置辅助分析区域和设备，以避免污染。
由于反应比较迅速，为了确保实验的重现性，建议模板DNA最后加入。
强烈建议设置未加模板的阴性对照，以确保扩增的特异性。
为了防止在配制试剂时发生污染，请务必在超净工作台内进行操作。
试剂及模板DNA的配制操作尽量需要和PCR产物的电泳等分析在不同的区域进行，以免发生污染。

反应程序：65℃ 60分钟。
灭活：80℃加热5分钟。
如实验需要，可以用2.0%的琼脂糖凝胶进行电泳分析，电泳图显示扩增产物为梯度条带为阳性，无梯度条带为阴性。

Bst8.0 DNA聚合酶活性效果参考图1。

图1．Bst8.0 DNA聚合酶进行环介导等温扩增反应的效果图。在25μL体系，以相同量(0.1ng)的pCMV-Cre-EGFP质粒(货号：YTB3401)为模板，使用不同剂量的本制品、Bst6.0 DNA聚合酶(货号：YTB4100)和N公司(Competitor)的Bst 3.0 DNA Polymerase，引物：1.6μM FIP/BIP，0.2μM F3/B3，0.4μM Loop F/B，1.4mM dNTP each，在1×Bst 8.0 Reaction Buffer (2mM MgSO4)中补加MgSO4至终浓度为8mM，65℃孵育1小时，80℃加热20分钟灭活，然后进行2.0%的琼脂糖凝胶电泳检测。如图所示，本制品与Competitor N公司的产品和Bst6.0 DNA聚合酶(货号：YTB4100)相比，在1小时的反应时间内具有相当的酶活性。-，仅未添加酶的阴性对照；+，仅未添加模板的阴性对照；M,DNA Ladder(200bp～12kb，含溴酚蓝，货号：YT425)。实际操作时不同实验条件获得的实验结果会略有差异，图中所示结果仅供参考。
Bst8.0 DNA聚合酶进行环介导等温扩增反应可耐受72℃高温的效果图参考图2。

图2．Bst8.0 DNA聚合酶进行环介导等温扩增反应的耐高温(72℃)效果图。在25μL体系，以相同量(0.1ng)的pCMV-Cre-EGFP质粒(货号：YTB3401)为模板，使用不同剂量的本制品、Bst6.0 DNA聚合酶(货号：YTB4100)和N公司(Competitor)的Bst 3.0 DNA Polymerase，引物：1.6μM FIP/BIP，0.2μM F3/B3，0.4μM Loop F/B，1.4mM dNTP each，在1×Bst 8.0 Reaction Buffer(2mM MgSO4)中补加MgSO4至终浓度为8mM，72℃孵育1小时，80℃加热20分钟灭活，然后进行2.0%的琼脂糖凝胶电泳检测。如图所示，本制品与Competitor N公司的产品相比，具有类似的耐高温(72℃)特性；与Bst6.0 DNA聚合酶(货号：YTB4100)的产品相比，具有更佳的耐高温特性(72℃)。-，仅未添加酶的阴性对照；+，仅未添加模板的阴性对照；M,DNA Ladder(200bp～12kb，含溴酚蓝，货号：YT425)。实际操作时不同实验条件获得的实验结果会略有差异，图中所示结果仅供参考。
Bst8.0 DNA聚合酶进行实时荧光逆转录环介导等温扩增反应(RT-LAMP)具有更快的反应速度参考图3。

图3．Bst8.0 DNA聚合酶进行实时荧光逆转录环介导等温扩增反应(RT-LAMP)的效果图。在25μL体系，以相同病毒滴度(2×10³IU)的RNA病毒(新型冠状病毒N基因假病毒，货号：YTC3001)为模板，使用相同量的本制品、Bst6.0 DNA聚合酶(货号：YTB4100)和N公司(Competitor)的Bst 3.0 DNA Polymerase，引物：1.6μM FIP/BIP，0.2μM F3/B3，0.4μM Loop B，1.4mM dNTP each，在1×Bst 8.0 Reaction Buffer (2mM MgSO4)中补加MgSO4至终浓度为8mM，进行RT-LAMP反应(PCR程序：65℃ 15s，65℃ 45s (采集信号)；溶解曲线程序：95℃ 15s，65℃ 15s，95℃ 15s)。如图所示，Bst8.0 DNA聚合酶(货号：YTB4101)和Bst6.0 DNA聚合酶(货号：YTB4100)比N公司(Competitor)的产品具有更快的反应速度。实际操作时不同实验条件获得的实验结果会略有差异，图中所示结果仅供参考。
Bst8.0 DNA聚合酶进行实时荧光逆转录环介导等温扩增反应(RT-LAMP)可耐受高浓度的dUTP参考图4。

图4．Bst8.0 DNA聚合酶进行实时荧光逆转录环介导等温扩增反应(RT-LAMP)的高dUTP耐受性的效果图。在25μL体系，以相同病毒滴度(2×10³IU)的RNA病毒(新型冠状病毒N基因假病毒，货号：YTC3001)为模板，使用相同量的本制品、Bst6.0 DNA聚合酶(货号：YTB4100)和N公司(Competitor)的Bst 3.0 DNA Polymerase，引物：1.6μM FIP/BIP，0.2μM F3/B3，0.4μM Loop B，1.4mM dNTP each，1.4mM dUTP，0.04U UDG酶(货号：YTB4034)，在1×Bst 8.0 Reaction Buffer (2mM MgSO4)中补加MgSO4至终浓度为8mM，进行RT-LAMP反应(PCR程序：65℃ 15s，65℃ 45s (采集信号)；溶解曲线程序：95℃ 15s，65℃ 15s，95℃ 15s)。如图所示，Bst8.0 DNA聚合酶(货号：YTB4101和Bst6.0 DNA聚合酶(货号：YTB4100)比N公司(Competitor)的产品在相同高dUTP浓度(1.4mM dUTP)时具有更快的反应速度，即更好的耐受性，其中Bst8.0 DNA聚合酶(货号：YTB4101)效果最佳。实际操作时不同实验条件获得的实验结果会略有差异，图中所示结果仅供参考。

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